原代細胞分離培養(yǎng)有哪些注意事項？

　　1、組織塊培養(yǎng)法

　?。?）接種后的前3天，觀察和移動時注意不要引起液體振蕩。避免頻繁的翻倒和振動，否則組織塊不易附著在瓶壁上或附著后脫落飄浮。

　?。?）加入的培養(yǎng)基不宜過多，以免浸泡的組織因輕微波動而脫落。

　?。?）細胞向外遷移時，注意記錄并清除漂浮的組織塊和殘留細胞。它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會影響原代細胞的生長。

　?。?）為促進組織塊盡快貼在培養(yǎng)瓶上，可在種植前在培養(yǎng)瓶底壁涂上一層薄薄的膠原蛋白。

 

　　2、貼壁原代細胞

　　（1）原代細胞分離培養(yǎng)的分離細胞一次接觸體外環(huán)境時，會相互影響。這些細胞之間可以產(chǎn)生一些促生長活性物質(zhì)，促進細胞的存活和生長。如果接種細胞的密度過低，細胞間的促生長作用就很小，細胞分散后很難適應(yīng)從體內(nèi)組織環(huán)境到獨立生存環(huán)境的變化過程。如果接種的細胞密度過高，會導(dǎo)致營養(yǎng)供給不足，代謝廢物迅速堆積，需要頻繁換液和通過。

　　（2）適當(dāng)提高原代培養(yǎng)接種的細胞密度，為培養(yǎng)細胞提供更多與體內(nèi)相似的細胞間相互作用，將大大提高原代培養(yǎng)細胞在體外的存活率。當(dāng)細胞適應(yīng)體外環(huán)境后進行傳代培養(yǎng)時，以較低的密度進行接種和培養(yǎng)。

　?。?）接種后的細胞盡快貼壁是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。接種后可將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h～5h。待細胞貼壁后，可補充培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

　　3、懸浮型原代細胞

　?。?）原代細胞分離培養(yǎng)細胞必須保持懸浮狀態(tài)。可以通過增加培養(yǎng)基的粘度來懸浮細胞，例如在培養(yǎng)基中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。將培養(yǎng)基加入帶攪拌裝置的培養(yǎng)容器中，最少5ml，否則攪拌時會產(chǎn)生氣泡，對細胞造成損傷。這種方式要注意攪拌速度不要太快，否則培養(yǎng)基會溢出，容易造成污染。如果培養(yǎng)基的量小于5ml，可以使用旋轉(zhuǎn)瓶進行培養(yǎng)。更換懸浮培養(yǎng)細胞溶液時，注意不要吸出細胞。

　?。?）可懸浮培養(yǎng)的細胞一般活力強，體外分裂增殖快，營養(yǎng)物質(zhì)消耗大，換液時間間隔短。